Effet de Serenoa repens (Permixon®) sur l’expression des gènes liés à l’inflammation : analyse dans des cultures de cellules primaires de carcinome de la prostate humaine | Journal de l’inflammation

Effet de Serenoa repens (Permixon®) sur l’expression des gènes liés à l’inflammation : analyse dans des cultures de cellules primaires de carcinome de la prostate humaine | Journal de l’inflammation

lignées cellulaires

Les lignées cellulaires LNCaP et PC3 ont été obtenues auprès de Interlab Cell Line Collection (ICLC) (Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Gênes, Italie).

La lignée de cellules épithéliales cancéreuses humaines PC3 a été cultivée dans du DMEM (Euroclone, Division des sciences de la vie, GB, Pero, Italie) additionné de 10% de sérum bovin fœtal (Euroclone) et de LNCaP dans du RPMI 1640 (Euroclone). Les cellules ont été maintenues dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C, 5 % de CO2. Les cellules ont été traitées avec LSESr (44–88 μg/ml) à différents temps d’incubation (24, 48 et 72 heures) et après extraction de l’ARN, le test RT-PCR a été effectué aux mêmes intervalles de temps.

Cultures primaires ex vivo

Cette étude expérimentale a été menée après approbation du protocole par notre comité du conseil d’administration institutionnel et le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients. Les critères d’exclusion de l’étude étaient les suivants : traitements hormonaux, chirurgicaux ou radiothérapies antérieurs pour les maladies de la prostate ; maladies inflammatoires aiguës. Le tableau 1 résume les caractéristiques des donneurs.

Tableau 1
Caractéristiques cliniques des 40 cas inclus pour l’analyse sur cultures primaires (nombre de cas et moyenne ± ET)

Nous avons dérivé des cultures épithéliales humaines à partir de tissus prélevés sur 40 patients subissant une prostatectomie radicale pour un adénocarcinome de la prostate. Lors de la chirurgie, après ablation de la prostate, les échantillons de tissus ont été placés sur de la glace dans un tube Falcon contenant 5 ml de milieu minimum essentiel (Euroclone) et transférés en laboratoire où ils ont été immédiatement traités. A partir de ces cas (40 cas), nous avons traité des fragments de tissus provenant soit de nodules PC (nommés tumeur « T »), soit de tissus normaux (nommés contrôle « Ct »). L’état histologique du tissu a été vérifié par un pathologiste indépendant.

En bref, les échantillons frais de tumeur et de tissu normal ont été coupés en petits morceaux et digérés avec de la trypsine sous agitation pendant 2 heures à 37°C. Après filtration à travers une passoire cellulaire en nylon de 70 m, les cellules épithéliales ont été cultivées dans du PrEGM (Prostate Epithelial Growth Medium), contenant les additifs standards pour les cellules épithéliales prostatiques (PrEGM Bullet Kit), y compris l’extrait hypophysaire bovin, l’insuline, la transferrine, le facteur de croissance épidermique, l’hydrocortisone. , acide rétinoïque, épinéphrine et triiodothyronine, de Lonza.

Après deux semaines, lorsque les différentes cellules ont montré un taux de croissance exponentiel, elles ont été traitées avec du LSESr (Permixon®, Pierre Fabre Médicament, Castres, France).

Préparation du LSESr (Permixon®) et des paramètres de stimulation

Le LSESr (Permixon) a été obtenu sous la forme d’un extrait à l’hexane de Pierre Fabre Médicament (Castres, France). L’hexane a été évaporé pour laisser l’extrait solide. Le solide a été dissous dans 10 ml d’éthanol, pour donner une concentration de 10 mg/ml. Cette solution mère a ensuite été diluée dans un milieu approprié pour fournir une solution de travail de 1 mg/ml.

comptage de cellules

Pour déterminer le nombre de cellules, LNCaP, PC3 et les cellules prostatiques primaires ont été étalées et les cellules sous-confluentes ont été traitées avec LSESr (Permixon) à une concentration de 44 et 88 μg/ml à différents temps d’incubation (6, 9, 24, 48 et 72 heures ). Après traitement, les cellules ont été trypsinisées, lavées dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et après centrifugation (5 min à 500 g) ont été remises en suspension dans du PSB (50-100 1). Une aliquote de chaque lignée cellulaire a été diluée 1:1 avec 0,4 % de bleu trypsan. Les cellules ont ensuite été chargées dans une chambre de Neubauer et les cellules vivantes (non colorées) ont été comptées sous un microscope optique. Chaque essai a été réalisé en triple et la valeur moyenne a été déterminée.

Test cytotoxique

Les cellules LNCaP et PC3 ont été ensemencées en triple dans des plaques à 96 puits à 5, 0 × 104 cellules par puits. après 24 heures, Serenoa Repens (44 μg/ml) a été ajouté dans un milieu DMEM sans phénol rouge pendant 48 et 72 heures, puis les cellules ont été incubées avec du 2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-Sel interne de 2H-tétrazolium-5-carboxanilide (XTT ; kit de prolifération cellulaire Sigma-Aldrich) en suivant les instructions du fabricant.

L’absorbance a été mesurée à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques (Labsystem Multiskan MS), l’absorbance à 690 nm a été soustraite de la valeur à 450 nm et la cytotoxicité a été calculée en comparant l’absorbance des cultures traitées à l’absorbance des cultures non traitées à 48 et 72 heures. .

Détection des caspases

Dans la lignée cellulaire PC3 et dans les cultures primaires, un anticorps anti-caspase-3 activé (Cell Signaling Technology) a été utilisé pour effectuer un test d’immunofluorescence et pour étudier l’apoptose induite dans différentes cellules par LSESr (Permixon). Les cellules ont été cultivées sur des lames de chambre Labteck (Nunc, Naperville, Illinois, États-Unis) pendant 24 heures, puis traitées avec LSESr (Permixon) 44 μg / ml pendant 16 heures et analysées par immunocytochimie en utilisant un marquage indirect anti-clivée caspase-3 et rhodamine. Les cellules traitées et les témoins ont été fixés et perméabilisés dans du méthanol à -20°C pendant 10 min, rincés dans du PBS, incubés pendant 1 heure à température ambiante avec des IgG anti-lapin conjugués au TRITC (1:500, Molecular Probes) puis examinés sous microscope à fluorescence (Olympus BX-52).

Essai de réaction en chaîne par polymérase de la transcriptase inverse (RT-PCR)

L’ARN total de LNCaP, PC3 et de cellules primaires de la prostate humaine a été extrait à l’aide du réactif Trizol (Invitrogene, Carlsband, CA) conformément aux instructions du fabricant. Des préparations d’ARN de haute qualité ont été remises en suspension dans de l’eau sans nucléase et soumises à une réaction en chaîne par polymérase semi-quantitative (RT-PCR). La transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney (M-MLV) (Biolab) a été utilisée pour convertir 1 ug d’ARN total en ADNc à 42°C. 5 µg de chaque ADNc ont ensuite été soumis à une RT-PCR dans un tampon contenant 25 pmol d’amont et d’aval et 1,25 U de Platinum Taq polymérase (Euroclone). La quantité de produits amplifiés, exprimée en unités de densité optique arbitraires, a été normalisée avec la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GADPH) comme gène de ménage. Les séquences d’amorces spécifiques du gène humain et les conditions d’amplification ainsi que la taille des produits amplifiés sont répertoriées dans le tableau 1, avec ordre direct et inverse. La réaction d’amplification a été réalisée dans des cycleurs exprimés par PCR (TECHNE USI Instrument). Les produits de PCR résultants ont été séparés dans un gel d’agarose à 2 % et visualisés avec du bromure d’éthidium. Les séquences d’amorces, les tailles d’amplification et les conditions d’amplification pour chaque gène sont répertoriées dans le tableau 2.

Tableau 2
Séquences d’amorces et conditions d’amplification

Immunofluorescence

Le protocole a été réalisé uniquement dans les lignées cellulaires de culture LNCaP et PC3. Les cellules ont été cultivées sur des lames de chambre Labteck (Nunc, Naperville, Illinois, États-Unis) et traitées avec du LSESr (Permixon). Après traitement, les cellules ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et fixées avec du méthanol absolu pendant 5 minutes à -20 ° C. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 1 heure avec un anticorps polyclonal de lapin anti-p65 (Santa Cruz Biotechnology), rincées trois fois avec du PBS puis incubées avec une IgG anti-lapin conjuguée à l’isothiocyanate de fluorescéine (Sigma, Milano, Italie) pendant 1 heure. Les cellules ont ensuite été rincées trois fois avec du PBS et montées avec le réactif anti-fade Prolong, et la fluorescence a été analysée par un microscope à fluorescence Olympus BX52 (Hambourg, Allemagne). Les images ont été acquises et élaborées avec le logiciel IAS 2000 (Delta Sistemi, Rome, Italie).

analyses statistiques

La signification statistique a été déterminée à l’aide d’un test de Student unilatéral. t (logiciel d’analyse statistique PRISM) et les données ont été exprimées sous forme de moyenne ± écart-type (ET) d’échantillons indépendants provenant de différentes expériences. Un seuil de p < 0,05 a été utilisé pour démontrer la signification.